建立了一種新的基于微流控液滴形成技術的聚乙烯醇(Poly(vinylalcohol)，PVA)微球制備方法。在微流控芯片上利用液滴形成技術可以快速、連續產生尺度均一、單分散性好的PVA液滴。液滴制備速度可以達到7個/s。并且通過改變制備液中兩相流體的注入流量和微流控通道寬度可對生成的PVA液滴的尺寸進行調節。將收集得到的PVA液滴進行物理交聯固化處理，可以獲得大量尺寸均一的聚乙烯醇微球。本方法制備效率高，所得到的微球單分散效果好，而且微球形成不需要化學交聯劑的摻入，避免了對包載物質的干擾，非常適合藥物載體等應用。
1引言
藥物載體是一種可以改變藥物進入人體的方式、控制其在體內的分布和釋放速度并將其輸送到靶向器官的體系，很多新型的藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度，因而相關研究受到越來越廣泛的關注。
現有藥物載體的研究主要集中在微粒、脂質體、凍干粉、復乳及凝膠、納米材料等新型輸送系統。把藥物溶解或者分散在高分子材料基質所形成的微小球狀實體(微粒或微球)中就可以實現微粒載體的包載。包載藥物的微粒通過特定表面修飾，在注入機體后，可對特定器官和組織起靶向識別作用。同時，微球中的藥物的釋放可以通過調控藥物溶解度、物理狀態、藥物-微球親和力等因素來調節，達到可控緩釋等目的。其中，基于聚乙二醇-聚乳酸共聚物(PELA)、殼聚糖、海藻酸鈉等材料的微粒藥物載體由于制備難度較低、物化性質穩定、包封率和保護率較高等優點而得到廣泛應用。但是，這些微粒載體制備方法仍存在有機溶媒殘余量大、殘留溶劑毒性大、工藝復雜、操作時間過長、藥物穩定性易破壞等問題。因此，尋求新的藥物微粒載體制備方法仍是該領域的研究熱點。
相對于其它藥物載體材料，聚乙烯醇(PVA)具有良好的生物相容性和親水性，在生物體內能夠緩慢降解;并且PVA材料無毒、價格低廉、來源豐富，因而在生物醫學領域得到了廣泛應用。基于PVA的微粒(微球)常被用作藥物載體和血管栓塞劑。
目前，PVA微球制備常采用乳化交聯、輻射交聯和物理交聯等方法。乳化交聯是將作為分散相的PVA溶液與連續相混合，在一定溫度下攪拌乳化一定時間后，再加入交聯劑和催化劑攪拌，即可得到交聯固化的PVA微球。該方法制作微球時，水相和油相混合攪拌乳化形成的PVA液滴大小不均，且尺寸很難控制，固化后得到的微球分散性差且形態也不規則。輻射交聯是使用高能射線(如γ射線)對PVA溶液進行照射，進而實現固化的方法，這種方式實驗條件相對較難，并且操作要求比較高。物理交聯常采用分散相注射滴加的方式在大量溶液中形成PVA液滴，然后利用冷凍-解凍方法使PVA液滴固化形成微球。該方法形成的微球分散性較普通乳化交聯法有了較大改善，而且也避免了交聯劑和催化劑的殘留。但是，這一方法所得到的微球通常尺寸較大(～1mm)，難以滿足大多數的載藥要求。
微流控液滴形成技術是近年來出現的微流控技術，可以在微流控通道內實現液滴生成和液滴操作。該技術需要被制備成液滴的分散相和連續相在通道內通過連續的相互作用生成液滴。微流控芯片上生成得到的液滴單分散性好，制備過程可實時觀測分析，通過調節芯片液相的注入流量，可控制液滴的生成速率和大小。同時，通過設計通道結構和尺寸，也可以對液滴尺寸進行控制。本研究利用微流控液滴形成技術制備PVA液滴，所獲得的PVA液滴不需要額外的收集過程即可進行物理交聯固化，通過冷凍-解凍方法使PVA液滴固化獲得凝膠微球。
2實驗部分
2．1儀器與試劑
ＲDT高速攝像儀；AE31顯微鏡；B-95504微泵；101-233數顯鼓風干燥箱；PDC-MG等離子清洗儀；DZF-6050真空干燥箱；HH2K2水浴鍋。
司盤80；聚乙烯醇；二甲基硅油；聚二甲基硅氧烷。
2．2芯片設計及加工
使用AutoCAD制圖軟件繪制芯片的通道結構(圖1A)，前端兩條進樣支路的夾角為135°，中間通道為不同曲折程度的蛇形通道，蛇形通道末端接長方形收集池結構。其中，進樣支路和中間蛇形結構的通道寬度相同。
圖1(A)芯片結構示意圖;(B)制備的微流控芯片照片Fig．1(A)Diagramofchipstructure;(B)Photooffabricatedmicrofluidicchip的通道寬度相同。
采用軟光刻工藝制備SU-8陽模。將適量PDMS前聚體與固化劑按10∶1的比例攪拌混合均勻，抽真空除去氣泡，然后澆于培養皿內的模板上，厚度約為0．5cm。把培養皿水平放在75℃鼓風干燥箱內固化1h后取出。從模板上揭下固化的PDMS膠塊，用打孔器在微通道進樣孔的位置打通孔，用手術刀切出收集池。將PDMS和載玻片的待鍵合面朝上放入等離子清洗儀中清洗2min后取出，將處理后的兩面鍵合在一起。在進出樣孔上插入聚四氟乙烯導管，并用PDMS膠封合，再次于75℃固化，即可得到芯片(圖1B)。將芯片置于顯微鏡觀察平臺，并將導管與微量注射泵連接，即完成實驗系統的搭建。
2．3實驗方法
2．3．1PVA溶液的配制
精密稱取PVA-1799(聚合度1700，醇解度99%)2．5g，蒸餾水47．5g，加入到錐形瓶中90℃水浴3h，待PVA完全溶解后，即配制成質量分數為5%的PVA溶液。為了減少水浴過程中錐形瓶中的水分蒸發，錐形瓶用保鮮膜封口。
2．3．2連續相配制
將3mL表面活性劑Sapn-80加入到97mL二甲基硅油中，超聲振蕩，使Span-80完全溶解于硅油中，即得到表面活性劑體積分數為3%的連續相。
2．3．3液滴制備
在兩個不同微量泵的注射器中分別吸取0．5mLPVA溶液和二甲基硅油，通過導管與浸潤好芯片的分散相及連續相入口孔相連接。將芯片置于顯微鏡的載物臺上(圖2A)，調節兩相液體的進樣流量，觀察并記錄液滴的形成情況(圖2B)。
2．3．4液滴的物理交聯
待液滴穩定生成后，對芯片收集腔室收集到的液滴進行固化處理。將芯片置于!80℃冷凍12h再室溫解凍8h，重復冷凍-解凍過程3次，即可得到固化的PVA微球。
3結果與討論
3．1通道結構對PVA液滴形成的影響
3．1．1蛇形通道
液相從兩側支路匯入交叉口之后，當芯片后端不接蛇形通道時，單直通道形成的后端流阻較小，連續相對分散相的作用力表現為水平加速其向后端流動的效果，而垂直的剪切力不足以將分散相剪切成液柱或者液滴，由于連續相和分散相的油/水不溶，在通道內形成兩相流的流動狀態。隨著后端彎折通道的增加(4彎折→8彎折→12彎折)，Y型交叉口位置形成的積壓越來越大，連續相對分散相的剪切力也隨之增大，分散相被剪切成的液柱逐漸變短至與通道寬度接近的尺寸。圖3是在相同的芯片通道寬度，通道浸潤時間和同一組進樣速率條件下(分散相50#L/h，連續相100#L/h)，不同的蛇形通道長度(彎折通道數)的芯片在交叉口形成液滴的情況。
圖2(A)實驗系統裝置;(B)液滴穩定生成Fig．2(A)Experimentalsystem;(B)Stableproductionofthedroplet
圖3(A)0彎折通道形成兩相流;(B)4彎折通道形成長液柱;(C)8彎折通道，液滴大小接近通道寬度;(D)12彎折通道，液滴大小接近通道寬度，但穩定時間較長Fig．3(A)0bendchanneltoformatwo-phaseflow;(B)4bendchannelstoformalongliquidcolumn;(C)8bendchannels，thesizeofdropletclosetochannelwidth;(D)12bendchannels，thedropletsizeclosetothechannelwidthforalongersettlingtime
芯片結構的后面部分設計成蛇形回路形狀能夠起到穩定通道內壓力的作用，有利于在前方Y交叉口位置更均勻的形成液滴。蛇形通道同時也起到了延長液滴在通道內的流動時間的作用，使得生成的液滴的形態在長時間的流動過程中更加規則。同時，液滴在彎折蛇形通道內的流動，方便觀察。
3．1．2通道寬度
微流控通道的寬度是影響液滴產生的一個重要因素，它限制了液滴的側向擴展距離，從而決定了液滴穩定連續生成時的最小粒徑尺寸。圖4A和圖4B中不同通道尺寸的芯片所生成的球形液滴，其直徑與產生它們的通道寬度基本一致。調節分散相和連續相的進樣流量，液滴穩定生成時的最小直徑接近通道寬度，分別為(100．86±0．69)μm和(200．71±0．76)μm(n=7，下同)。
3．2流量對液滴形成的影響
在兩相流體形成液滴的過程中，兩相流不同的流動速度會對流體間的擠壓、剪切過程產生影響，從而影響液滴的形成過程。在本研究中，分散相的進樣流量設定為15#L/h，連續相設置為10、13、15和20μL/h，20#L/h后開始以10#L/h的梯度逐漸增加。以Y夾角交叉口作為1min內液滴生成數量的統計觀察位置，使用高速攝像儀記錄1min內不同連續相進樣流量下生成液滴的數目情況，統計后計算得到單位時間內液滴的生成速率。生成液滴的長度(圖5A)和生成速率(圖5B)隨著連續相流動速度的變化而改變。當連續相的進樣流量為10μL/h時，連續相與分散相匯流時所產生的剪切力不足以切斷分散相，從而無法形成液柱或液滴。增大連續相流量，當流速達到13μL/h時，通道內有長液柱形成，長度為(681．71±1．11)μm，單位時間內的液滴(柱)生成數量為(3．14±0．69)個。隨著連續相流量的增大到15μL/h時，所形成液柱的平均液柱長度減小為(322．43±1．51)#m，但生成頻率增大到(4．00±0．58)個/s。連續相的流量從20μL/h增加到90μL/h的8個進樣流量下，液滴的長度不斷減小，分別為(312．29±1．60)#m、(196．43±0．98)#m、(162．86±1．07)#m、(154．57±1．27)#m、(138．43±0．79)#m、(136．86±0．69)#m、(130．57±0．53)#m、(126．71±0．76)#m，單位時間內生成液滴的數量逐漸增加，分別為4．43±0．53、5．57±0．53、5．71±0．76、5．86±0．38、6．14±0．38、6．29±0．49、6．43±0．53、6．57±0．79。當連續相增大到100μL/h后，所形成液滴的長度在100#m(通道寬度)左右微小變化，分別為(106．86±0．69)#m、(100．29±0．76)#m、(98．43±0．53)#m、(101．57±0．79)#m、(100．29±0．49)#m、(97．14±0．69)#m、(98．00±1．00)#m，此時液滴生成速度保持在7個/s，然后急劇減少，分別為6．71±0．76、6．71±0．49、6．86±0．38、7．14±0．38、5．86±0．69、2．57±0．53、0．71±0．49。當連續相進樣流量達到170μL/h時，通道內沒有液滴生成。
圖4(A)100μm通道寬度生成的液滴;(B)200μm通道寬度生成的液滴Fig．4(A)Dropletproducedinthechannelof100-μmwidth;(B)Dropletproducedinthechannelof200-μmwidth
圖5(A)液滴長度隨連續相變化情況;(B)液滴數量隨連續相變化情況Fig．5(A)Lengthofdropletchangeswithcontinuousflowrate;(B)Numberofdropletchangeswithcontinuousflowrate
當分散相流量一定時，隨著連續相流量的增大，連續相進樣支路形成的積壓壓力也逐漸增大。這個壓力形成的兩個分力(對分散相的剪切力、推動液滴向前運動的動力)也隨之增大。因此，在單位時間里連續相會截取得到更多，尺寸更小的液滴，同時向前的推動力也使液滴之間的距離增大。如繼續增大連續相的流量，剪切力分壓將會作用到分散相的進樣支路上，從而使剪切得到的液滴數目下降，但所得到的液滴在通道內的運動速度會加快。而當剪切力分壓大于分散相進樣支路壓力時，連續相進入分散相支路通道并阻礙分散相的流動，從而打破穩定生成液滴時的平衡狀態。由于是恒流進樣，受壓迫支路內的壓力不斷累積，會再次和另一進樣支路、蛇形通道形成穩定狀態，而在這個穩定狀態下，液滴的大小和生成速度較上一個穩定狀態將發生改變。因此，當分散相的注入流量為15#L/h時，選擇連續相流量為130μL/h時，可以得到較好的液滴形成效果，此時液滴制備速度可以達到7個/s。
3．3液滴的物理交聯固化
微芯片中形成的PVA液滴經微通道最終會流進收集池中，當收集池中收集一定數目的液滴后，連同微芯片一起置于!80℃冷凍環境下進行快速冷凍。快速冷凍法可以有效降低冷凍過程中PVA液滴的形態變化程度，從而保證最終得到的微球的球形形態的規則性。PVA液滴經過一次冷凍/解凍過程得到的凝膠微球的強度較低，是一個輕度物理交聯的過程，重復3次冷凍/解凍過程后的PVA凝膠微球達到了深度交聯，凝膠微球的強度大大高于輕度交聯的強度。隨著交聯程度深化，PVA聚合物的分子鏈間以及與水分子間的結合變得更加緊密，形成更多緊密的微晶區。單個PVA液滴宏觀上的變化表現為體積的縮小，3次交聯后的凝膠微球(圖6)的平均直徑為(84．12±1．64)μm，相比交聯前的(100．86±200滋m
圖6!80℃冷凍交聯3次后的PVA凝膠微球的電鏡圖Fig．6ScanningelectronmicroscopyimageofPVAgelmicrospheresafterthricefreezingcrosslinkingat!80℃0．69)μm(分散相15μL/h，連續相100μL/h)，直徑縮減了16．60%。
其它常用的PVA交聯固化法包括化學乳化法和輻射法。本研究采用物理交聯固化的方法，與乳化交聯法相比，由于未引入任何有毒的化學試劑，得到的PVA微球更加安全、可靠，有利于后期應用該載體開展靶向給藥、定點緩釋等領域的應用研究;相比于輻射交聯法，冷凍/解凍的物理交聯法操作簡便易行。
4結論
各種高聚物微球在藥物載體等領域得到了越來越廣泛的應用。相對于其他高聚物材料，聚乙烯醇在微球制備及應用方面具有獨特優勢。傳統制備方法得到的PVA微球的單分散性不佳，產率也較低，限制了這一材料的廣泛應用。
本研究采用微流控液滴制備技術連續產生大量尺寸均一的PVA液滴，通過物理交聯固化產生PVA微球。結果表明，通過使用不同通道寬度的芯片或者改變連續相和分散相的注入流量可以得到不同大小的PVA液滴。本方法制備得到的PVA微球單分散性效果好;同時，可根據需要調節微流控芯片內流動參數制備不同粒徑大小的PVA微球，并允許對制備過程實時觀測分析和調整。有助于參數優化和液滴制備效果的改善，相對于傳統大容積制備器皿，芯片的表面/容積比更大，加熱和降溫都更快，更有利于PVA液滴的物理交聯，芯片內所集成的收集腔室等微結構能夠富集微球，有利于收集等操作。
文獻來源分析化學 DOI: 10．11895 /j．issn．0253-3820．181156 作者：韓縣偉 張洪武 羅洪艷等（轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，部分內容有刪減，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）