細胞是構成生命體的基本單元，研究細胞的結構和功能對于生命規律的探索、疾病的診斷與治療以及藥物的篩選研發都具有極其重要的意義。臨床與科學研究應用中所涉及的細胞分析通常需要對細胞樣本進行多樣化的操縱，傳統手段在操縱微米尺度細胞樣本方面存在著效率低、精度差以及成本高等缺點。
微流控（microfluidics）是一種處理或操縱微量流體的技術，其涉及化學、流體力學、微電子、材料學、生物學等交叉學科。微流控芯片作為微流控系統的核心，也常被稱為芯片實驗室（lab-on-a-chip，LOC）和微全分析系統（micrototalanalyticalsystem，μ-TAS）。利用微流控芯片進行生物樣本處理與分析近些年已經成為微流控領域的研究熱點，多樣化細胞樣本處理與分析任務往往需要對細胞樣本進行多樣化操作，如富集、分選和捕獲等。在微流控芯片上，不僅能進行群體細胞的高效操縱，而且能進行單細胞層面的精準操縱。
當前，基于微流控的細胞操縱方法主要分為主動式與被動式兩大類。主動式指利用主動控制所產生的外力實現流體和細胞的操縱，常見的有閥控、電控、磁控、光控和聲控，具有可控性好、準確度高等優點。被動式方法利用結構與流體、細胞與流體以及細胞與結構間的交互耦合作用，即流體動力學的原理實現對流道內的流體與細胞運動的精確控制，其具有系統簡單、樣本處理通量高等優點。本文總結近年來基于微流控芯片的細胞操縱方法與應用研究現狀，介紹當前各種細胞操縱方法的基本原理，分析各種方法的優缺點，并展望微流控在細胞操縱領域的未來發展方向。
1基于流體動力學的細胞操縱
由于流體在微流通道中黏性力遠大于慣性力，芯片內的流體流動大部分情況下為層流。利用層流的幾何規律性，可以實現細胞在通道中的有序排布。如圖1（a）所示，在層流模式下，可利用多通道主動控制的鞘流實現通道內的細胞樣本聚焦。鞘流聚焦具有極好的可控性，不僅能實現細胞樣本聚焦寬度的調節，同樣也能實現細胞聚焦位置的控制。此外，鞘流聚焦可以適用于幾乎所有細胞樣本，因而也是目前應用最為成熟廣泛的細胞聚焦方法。基于鞘流聚焦可實現基于光學和電學檢測的細胞計數。此外，高效的細胞分離往往需要對細胞樣本進行預先聚焦，當細胞樣本被鞘流聚焦到微流通道一側時，不同尺寸的細胞可基于捏流分離（pinchedflowfractionation，PFF）原理實現分離。鞘流聚焦同樣可以用來進行高效的單細胞捕獲。U形微篩是常見的單細胞捕獲結構，合理的微篩尺寸設計可以保證單細胞捕獲的確定性。Raymond等利用鞘流聚焦并結合U形微篩位置的合理布局，實現了腫瘤細胞的順序、高效單細胞捕獲。
確定性側向位移（DLD）技術指利用精確設計的微柱陣列實現細胞操縱。如圖1（b）所示，該方法基于細胞與微柱陣列間的相互作用。微柱陣列中的大細胞與微柱陣列碰撞后發生側向位移，向一側匯聚，而小細胞在與微柱陣列碰撞后并不發生側移；按照其原流向流過陣列，不同大小細胞的側向偏移角度會不一樣，因而可基于DLD實現不同尺寸細胞的分離。該方法具有實驗過程簡單、結構緊湊、重現性好等優點，但是僅依賴尺寸無法實現大小形狀相似細胞的精確分選，限制了其在諸如細胞亞型分析等領域的應用。目前，大部分DLD芯片基于圓形微柱陣列，已經可以實現快速、高回收率的富集分選CTCs，然而大多只能工作在較低流速下，因此，其樣本處理通量仍不能滿足臨床應用的要求。Sturm等采用三角形微柱陣列提高了DLD芯片的細胞樣本處理通量，實現了在最高達10mL/min流量下從血液細胞中分離CTCs。
如圖1（c）所示，慣性微流控技術基于慣性升力對細胞進行操縱，利用流動聚焦原理可實現大小、形狀及變形能力不同的細胞的聚焦與分離。其芯片結構簡單，單位時間內的細胞樣本處理量大，且對細胞損傷較小，有利于保持較高的細胞存活率。然而，細胞間相互作用會大大降低該技術的細胞操縱效率，因此，僅適用于工作在一定的細胞濃度內，所以，基于該技術的血液細胞分選通常需要預先稀釋血液樣本。
基于各向異性微結構誘導產生的二次流同樣被廣泛應用于微流芯片內的細胞操縱。如圖1（d）所示，該方法通常在微流道內集成魚骨頭、傾斜陣列等有規律的微結構在垂直于主要流體方向的截面內產生二次渦流，細胞在渦流的驅動下會與通道結構產生相互作用，從而逐漸偏離起始流線。該技術可用于實現細胞在微流通道內的無鞘流聚焦，同時也可利用該技術分離不同尺寸大小和密度的細胞。
圖1常見的基于流體動力學原理的細胞操縱方法
2機械式的細胞操縱
機械式細胞操縱指通過外部施加機械力的方法直接或者間接地實現細胞操縱。目前，最常用的機械式方法為基于多層柔性薄膜的有源氣動微閥控制。Quake研究組率先提出了多層PDMS軟蝕刻技術（multilayersoftlithography），在單個微流控芯片上整合了可以快速、準確控制流體流動的有源氣動微閥。該氣動微閥的發明使在芯片上實現高密度的流體控制和大規模的功能集成成為可能，因而在微流控技術的發展歷程中具有里程碑意義，該氣動微閥也常被稱為Quakevalve。其結構示意圖如圖2（a）所示，其包含流動層與控制層，兩層之間為可變形薄膜。當通過控制層施加壓力時，薄膜變形與流動層通道貼合，阻斷流動層的液體流通，反之，當控制層不施加壓力或者施加較小壓力時，流動層則呈現打開或半打開狀態。如圖2（a）所示，如果在一條流道上順序排列了3個閥，通過對3個閥開關狀態的調控可實現蠕動泵的功能。因此，基于主動閥可實現微量細胞樣本在芯片內的精確、靈活操縱，同時還具有體積小、響應快、壽命長、工藝簡單、成本低等優勢，被廣泛用于群體和單個細胞的操縱。
圖2（b）所示為基于主動閥控制的自動化微流控細胞共培養系統，該系統同時具備活細胞成像功能。基于該共培養系統，研究人員從時間和空間角度研究了化學刺激調控下的單個免疫細胞的二次應激信號的產生及其在其他組織細胞中間的傳播過程。有別于傳統上研究細胞群體與群體、單細胞和單細胞之間的交互作用，該微流體裝置可通過氣動閥的精確控制實現單個免疫細胞與多個組織細胞的可控共培養。如圖2（c）所示，基于有源氣動微閥可實現微流控芯片上高通量的單細胞分離、裂解、反轉錄和基因組擴增等一些列操作。基于該技術，美國Fluidigm公司開發了一款名為C1?Single-CellAutoPrepSystem的單細胞自動化預處理系統，該系統可以一次性自動分離處理96個懸浮狀態的單細胞，目前該系統已經在全球很多高校和研究機構被用來進行單細胞基因組學研究。除了通過控制流體流動實現細胞操縱，氣動微閥還被用于產生機械力對細胞進行機械刺激，且可實現對細胞施力、頻率及作用時間的控制。在正常生理條件下，諸多細胞如骨細胞、心肌細胞及血管內皮細胞往往處在復雜的力學環境當中，細胞在生長過程中會受到外界機械力的刺激。因此，構建一個具備動態機械力刺激的細胞培養環境，對于研究機械刺激對細胞增殖和分化等方面的調控作用顯得極其重要。如圖2（d）所示為微流控芯片上典型的機械刺激細胞培養結構，通過調控下層氣動閥的進氣壓力，動態機械刺激便通過可變形的彈性薄膜施加于細胞、生物材料和組織上。通過在單一芯片上集成不同直徑的壓力腔室，可在同一芯片上的不同空間位置同時施加多路機械刺激信號。同時，該設計還可在可變形薄膜內集成應力傳感，方便實現施加于細胞之上機械應力的實時在線讀取。盡管氣動微閥在細胞操縱上具有精度高、響應快等傳統手段無法比擬的優點，但其外部控制設備過于復雜,如何簡化芯片的外部操作，使之適應研究人員的工作習慣，是基于氣動微閥控制的大規模集成微流控芯片需要不斷改進的技術問題。
圖2基于主動閥控制的細胞操縱
3電控細胞操縱
常見的電控細胞操縱方法有兩種：基于介電泳效應（DEP）和基于誘導電荷電滲效應（ICEO）。DEP力為粒子在非均勻電場中受到極化后與電場相互作用而產生的力。該作用力會引起粒子在非均勻電場中漂移運動，因而可利用DEP力實現生物細胞操縱。介電泳力的表達式為[32]
式中，FDEP為細胞所受的DEP合力；εm為細胞所處懸浮液的介電常數；r為細胞半徑；E為電場標量強度值；K(ω)為克勞修斯-莫索提因子，也常稱CM因子；ε?cell為細胞的復合介電常數；ε?m為懸浮液的復合介電常數；σ為電導率；ω為交流電場角頻率。
可見，細胞所受DEP力的大小取決于細胞尺寸、細胞和周圍溶液的介電性質、電場的梯度及電場頻率。如圖3（a）所示，DEP可分為正向和負向兩種，當Re[K(ω)]>0時，細胞受到正向力的作用而往強電場區域運動，當Re[K(ω)]<0時，細胞受到負向力的作用而向弱電場區域運動。Re[K(ω)]=0所對應的電場頻率。
被稱為臨界頻率，此時細胞所受介電泳力為0。因此，有明顯臨界頻率特征的兩種細胞可通過介電泳效應在微流控芯片內實現分離。DEP芯片的細胞操縱效率很大程度上取決于芯片電極的結構，當前大多數DEP芯片內的電極都是基于薄膜工藝的平面結構。如圖3（b）所示為一種基于平面叉指傾斜電極的細胞分離芯片[32]，該芯片利用重力沉降效應進行細胞預聚焦，當聚焦細胞流過傾斜電極表面時，細胞由于不同大小DEP力的作用而實現分離。該設計被成功用來完成了兩種尺寸相同的白血病細胞（THP-1細胞與OCI-AML3）的高效分離。除了在細胞分離方面的應用，DEP芯片還被廣泛用于病原體富集、細胞圖案化、單細胞捕獲等方面。DEP在細胞操縱方面具有易與微流體系統結合、免標記、對稀有細胞的高選擇性等優點。DEP細胞操縱系統需在低電導率的溶液中操縱細胞，而常見的生理溶液，如血液、尿液等大多是高導電度，需要對細胞樣本做嚴格的預處理，限制了操縱樣本，因此目前還沒有基于DEP的細胞操縱技術在臨床領域成熟應用。
ICEO是發生在物體表面的一種電化學效應，體現為一種電動條件下的非線性流體流動現象。如圖3（c）所示，在外加電場作用下，電場引起的誘導電荷擴散引發滑移形式的局部流體流動，而這些誘導擴散電荷分布在固/液界面上的邊界薄層中，即雙電層中。正因為雙電層的存在，才使得可將電場力作用在流體分子上，進而操控微流體運動。圖3（d）所示為一種基于3D激勵電極結構的ICEO芯片，通道底部中間鋪設的不接電的長條形金屬板為懸浮電極，當在激勵電極兩側電極施加交變電場時則可獲得懸浮電極表面的ICEO渦流。渦流在懸浮電極中央速度非常小，因而細胞可在渦流作用下被聚焦到懸浮電極中央。基于ICEO，可實現細胞在特定區域內的高效富集，也可實現指定區域內高通量、非接觸的單細胞捕獲。同時，ICEO還可當作微泵實現微流道內的可控流體輸送。ICEO微流控芯片可實現電極陣列與微通道小尺度集成，結構緊湊，易于加工，且懸浮電極無需外部電信號接入，因而可根據不同應用場景進行設計布局。然而，由于ICEO微流控芯片依賴誘導二次流，在連續進樣的情況下，其細胞操縱效率與精度將隨著流速增大而大打折扣，因而該方法同樣在連續樣本操縱上存在通量低的弊端。
圖3電控細胞操縱
4磁控細胞操縱
磁控細胞操縱是指利用永磁鐵或電磁鐵對細胞進行操縱。由于細胞本身通常既不表現順磁性，也不表現逆磁性，往往需要對細胞用免疫納米磁珠進行表面修飾。表面改性的納米磁珠通過抗體與抗原的特異性作用黏附在細胞表面，因而磁控法為一種基于標記的操縱方法。如圖4（a）所示，在外部磁場作用下，結合了磁珠的細胞在磁力驅動下會偏移原來的流線，因此，有磁珠結合與無磁珠結合的細胞可通過外部磁場操控實現高效分離與捕獲。磁控法目前已經被普遍用于在微流控芯片上分離純化CTCs，通過正向富集的方法，表面有磁珠特異性吸附的CTCs可以被準確地從血細胞中分離出來。正向富集法需要提前知道CTCs有別于其他血液細胞的特異性表面標志物，因而只能針對目前已知的腫瘤細胞進行分離。反之，負向耗散法可實現血液中腫瘤細胞的體外分離，該方法使用磁珠與白細胞特異性結合，通過磁控操縱逐級耗散白細胞達到分離純化CTCs的目的。該方法無需對CTCs進行磁珠吸附，適用于目前幾乎所有類型腫瘤細胞的分離。
基于免疫磁珠的方法進行細胞樣本的操縱簡單可靠，目前已經成熟應用于許多大型分析檢測平臺。然而，此方法很難做到同時分離純化多種細胞，且后續細胞與表面磁珠的分離也很困難。此外，磁珠吸附可能會對細胞膜蛋白和結構產生損害，不利于后續進一步的細胞培養分析，使其應用場景受限。
5光控細胞操縱
光控細胞操縱手段目前有兩種，即基于光鑷和光誘導介電泳（ODEP）的細胞操縱方法。光鑷對粒子的操縱能力首先被美國科學家ArthurAshkin發現，他發現強聚焦的激光束可以把介質當中折射率較高的物體拽向激光束的中間部位，并進一步在1987年首次發表了單光束梯度激光的光鑷效應。基于單色激光的光鑷對尺度介于納米與幾十微米之間的粒子都具有可操縱性，也可利用光鑷實現對活體生物細胞的操縱。且基于機器人輔助控制的光鑷可實現細胞的多維度自動化操縱，已被用于細胞力學、細胞輸運、細胞遷移等方面的研究。光鑷不僅能實現非連續流下的細胞操縱，也可結合微流控芯片實現連續流下的細胞操縱，其中最典型的應用當屬光鑷增強的微流控細胞分選。如圖4（b）中左圖所示，首先通過鞘流實現細胞樣本在通道上游的聚焦，通過細胞的熒光特征進行圖像識別，光鑷自動捕獲并拖動目標細胞使其發生跨流線的側向位移，從而使目標細胞被收集到特定出口。該方法具備準確度高、非侵入等優點。但光鑷對細胞產生的操縱力往往處于皮牛量級，因而連續流下的細胞操縱要求細胞進樣流速不能太高，且光鑷對細胞很難做到一次性大批量，這兩點限制了光鑷在高通量細胞操縱方面的應用。此外，光鑷系統外圍龐大的光路系統難以小型化，因而其成本也較高。
ODEP是一種基于DEP基礎上開發出來的一種新型微粒操縱技術，其粒子受力機制與傳統DEP一樣，即使用非均勻電場極化粒子并對其產生DEP力。兩者的不同點在于非均勻電場產生方式，相比傳統介電泳操縱，ODEP無需預先加工電極圖案。如圖4（b）中右圖所示，可利用DMD投影儀經顯微鏡頭投射光斑圖案到芯片基底上生成靈活可控的虛擬電極。其工作原理類似光伏發電，非晶硅基底材料在光的激發下產生光生載流子，導致光照區載流子濃度升高從而使光照區電導率迅速增加，進而導致光照區和暗區分壓不同，在粒子操縱空間內產生非均勻電場，從而實現細胞等生物粒子的DEP操縱。
ODEP同樣具備普通DEP非接觸、損傷小的優點，因而也被廣泛用于多樣化的細胞操縱，如CTCs分離、水凝膠內的細胞圖案化及在連續流下分離提取細胞核等。和普通光鑷相比，ODEP具有設備簡單，可實現小型化，且對操縱粒子的光學性質沒有要求，因而具有極大的靈活性。但是ODEP同樣存在和普通介電泳一樣的固有缺陷，即需在低電導率的溶液中操縱細胞，因而也限制了其他臨床上的應用。且ODEP芯片的基底由于沉積非晶硅而不透明，影響了利用倒置生物顯微鏡進行活細胞成像。
圖4磁、光、聲控細胞操縱
6聲控細胞操縱
聲控細胞操縱方法基于聲波進入微流體后所產生的復雜的流—固耦合效應來實現細胞操縱。聲波形式上分為體波與表面波，聲表面波（SAW）是一種只能在固體表面傳播的彈性聲波，其能量大部分集中在基底表面以下深度約幾個波長范圍內。由于SAW芯片具有頻率較高、能量集中、穿透性好、便于集成等優點，近些年已被大量研究用來進行微流控芯片上的細胞操縱。叉指換能器（IDTs）常被用來產生聲表面波，通過調節叉指電極的叉指間距可實現對SAW共振頻率的調控。SAW共振頻率可達GHz，故可用來實現微米甚至亞微米顆粒的精確操控。此外，改變IDTs的形狀還可實現對聲場分布的調控，使該操縱方法具備極大的靈活性。SAW器件采用標準維納加工工藝加工，具備極好的重復性和一致性，且平面加工方法使其可實現與微流控芯片的集成。當聲波傳播進入流體媒介中，流體通過吸收聲波而獲得動量，從而發生整體移動，這種現象被稱為聲流效應。當流體中的粒子尺寸遠小于波長且質量很小，那么它就會隨著流體運動，這樣即實現了對流體中粒子運動的操控。基于聲流可以在微流控芯片上實現細胞樣本的富集、篩選等操作，例如Cooper課題組利用聲流實現了血液液滴內瘧疾感染與未感染紅細胞的富集和分離。由于被瘧疾感染的紅細胞密度小于正常紅細胞，因而在聲流操縱下，未感染紅細胞被富集在液滴中間，而被感染細胞則被富集與液滴邊緣。整個過程可在5s內完成，由此快速實現了病原體的非標記富集與分離。如圖4（c）左圖所示，當兩列頻率相同聲表面波相向傳播產生疊加時，就會產生聲表面波駐波（SSAW）。在SSAW的影響下，粒子將會受到駐波聲輻射力，進而聚集在波腹或波節位置，粒子會匯聚于波腹還是波節取決于粒子和周圍媒介的性質，如密度和可壓縮系數。聲輻射力主要是由于粒子對聲波產生反射、折射、吸收等效應，進而導致動量在聲波與顆粒之間發生交換。聲輻射力的大小與SSAW的波長、振幅及粒子的尺度和密度等物理性質相關。近些年，大量研究工作在微流控芯片上產生SSAW實現了細胞的精準高通量操縱，如細胞分選、單細胞捕獲、細胞圖案化共培養。圖4（c）左圖[57]所示，不同尺寸的細胞由于所受聲輻射力不同，因此在連續流動的流體中，尺寸大的細胞產生了往波節方向的較大側向偏移，而小細胞偏移不明顯，因而利用SSAW實現了基于尺寸差異的細胞連續分離。圖4（c）右圖為Huang課題組基于SSAW通過順序圖案化排列的方法實現了兩種細胞的圖案化共培養，兩種細胞在通道內不同位置排列的實現基于使用頻率相同而相位相反的兩種激勵信號。
聲控技術在細胞操縱上具有非接觸、無損傷、穿透性較好等優點。然而，聲控技術在微流控細胞操縱領域的應用還處于起步階段，仍有大量問題有待解決，譬如需要進一步研究聲波、流體和細胞之間的非線性相互作用。當前的聲控芯片大多基于LiNbO3基片，材料單一，亟待研究基于新型壓電材料的聲波器件基片。
7結論
利用微流控技術進行生物細胞的多樣化高效操縱一直是交叉學科領域的研究熱點。綜述了用于微流控細胞操縱的常見方法及其應用，并對各類方法的優缺點進行了討論總結。可以看出，每種方法都存在著其固有優勢與缺陷。總體上，基于流體動力學的被動式方法可實現細胞樣本的高通量操縱，但是其在細胞操縱精準度與靈活性上存在不足；而電控、光控等主動式方法具有準確度高、可靈活控制的優點，但由于電、光、聲、磁場在操縱微米尺度細胞上存在操作力較小等缺點，因而無法做到連續流體下的高通量細胞操縱。因此，實際應用中，往往需要結合多種方法，在保證高通量的同時實現高效、準確的細胞操縱，并盡可能減輕對細胞造成的附加損傷。目前能夠勝任各種細胞操縱任務的完美方法幾乎不存在，因而在研究過程中應將多種方法加以結合，實現1+1>2的效果是微流控細胞操縱領域今后需要研究的方向，同時，要不斷改進現有技術，并開發用于細胞操縱的新方法與新技術。此外，從實驗與理論模擬上研究揭示流體光學、流體細胞力學以及微流體力學等微流控中涉及的基礎理論規律也將成為助力微流控細胞操縱技術發展的重要手段。最后，基于當前幾乎所有微流控細胞操縱方法都是進行體外的細胞操縱，因此未來將微流控芯片植入皮下、血管等組織器官中，實現直接在人體內進行精密的細胞操縱預分析，實現疾病的無創、微創診斷與治療也是值得期望的方向。
（文章來源：科技導報2018,36（16）作者：孫東羅濤轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）