輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用使得不育夫婦得以實現(xiàn)妊娠生子的愿望,由不育引發(fā)的相關(guān)問題也隨之得到解決。體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transplantation, IVF-ET),即試管嬰兒,是輔助生殖技術(shù)的重要內(nèi)容。該技術(shù)是指將從母體取出的卵子體外受精并發(fā)育成前期胚胎后移植回母體子宮內(nèi),經(jīng)妊娠后分娩嬰兒。歷經(jīng)60 余年的發(fā)展,IVF-ET 已經(jīng)得到廣泛推廣并成為治療不孕癥的主要手段。盡管IVF-ET 取得了巨大成功,該技術(shù)仍存在許多不足,其中最突出的問題包括妊娠率低、多胎妊娠發(fā)生率明顯增高和出生后缺陷風(fēng)險增高 。究其原因,主要是由于現(xiàn)有細胞培養(yǎng)技術(shù)不能有效模擬體內(nèi)條件,因而影響了胚胎質(zhì)量。因此,現(xiàn)實醫(yī)療工作中迫切需要一種能夠模擬子宮環(huán)境,保證高質(zhì)量受精和胚胎發(fā)育的細胞培養(yǎng)技術(shù)。微流控芯片是組織、器官仿真的有力工具。一方面,微流控通道具有與體內(nèi)微血管相似的尺寸,在這個尺度下流體所具有的層流特性便于實現(xiàn)精確的流體控制;另一方面,通過芯片材料和芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計,可以有效模擬組織或器官的結(jié)構(gòu)和功能。前期研究報導(dǎo)了一系列基于微流控芯片的精子分選、受精以及胚胎發(fā)育等單元操作技術(shù)提高胚胎質(zhì)量。本工作設(shè)計了一種微流控芯片子宮,保證在類似子宮內(nèi)部的環(huán)境下實現(xiàn)排卵、受精和胚胎發(fā)生。初步結(jié)果顯示,芯片子宮較之傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)平臺可以獲得更高的桑椹胚率和囊胚率。
實驗部分
芯片結(jié)構(gòu)與加工
芯片包含3 層結(jié)構(gòu),頂層和底層為PDMS 而中間層為多孔PC 膜(圖1a)。PDMS 層采用標準軟刻蝕工藝加工。首先在平板玻璃上完成SU-8 模板的制作。取直徑為3 英寸的玻璃置于濃H2SO4-H2O2(3：1, V / V)中煮沸30 min,取出后用蒸餾水沖洗3 次,并在蒸餾水中超聲清洗2 次,每次30 min。超聲后的玻璃用氮氣吹干,備用。將潔凈玻璃置于勻膠臺,向其中心處滴加SU8 3025 光刻膠,勻膠機轉(zhuǎn)速為600 r/ min,持續(xù)30 s,升高轉(zhuǎn)速至1000 r/ min,再持續(xù)30 s。鋪膠后的玻璃置于烘膠臺上進行前烘,95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷卻后,用掩膜覆蓋玻璃表面的SU-8 膠層,置于紫外光刻機下曝光20 s。曝光后立刻將玻璃置于烘膠臺上95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷卻后將其置于顯影液中,輕輕震蕩進行顯影,之后用電吹風(fēng)將其吹干。最后,將模板置于175 ℃烘箱中烘1 h,進行堅模以得到SU-8 模板。將Sylgard184 單體與引發(fā)劑按體積比10:1 混合均勻,導(dǎo)入SU-8 模板,將模板置于真空氣缸內(nèi)真空脫氣。脫氣后置于80 ℃烘箱固化1 h,自然冷卻后將PDMS 從模板上剝離,剝離后在入口和出口處打孔。芯片頂層含有寬500 μm,高110 μm 蜿蜒形通道,通道中交錯分布一系列用于捕獲卵細胞的弧形篩網(wǎng),篩網(wǎng)直徑150 μm,由6 根直徑35 μm 的微柱圍成。芯片底層含有4 個平行的矩形通道,兩端與共同的入口和出口連接。通道底面具有4*3 微柱陣列用于支撐PC 膜。PC 膜處理按照文獻的方法,將PDMS 層等離子處理后與APTES 處理的PC 膜封接,步驟如下:淤將需要封接的PDMS 及PC 膜表面氧等離子處理1 min;于等離子處理后的PC 膜浸泡于5% APTES 溶液中20 min;盂將PC 膜取出,用蒸餾水沖洗3次,以去除表面未結(jié)合的APTES,氮氣吹干薄膜;榆將PDMS與PC膜加壓接觸1 h,實現(xiàn)兩者的有效封接。
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圖1 a. 芯片結(jié)構(gòu)立體示意圖; b. 芯片結(jié)構(gòu)截面圖說明芯片對于子宮結(jié)構(gòu)的仿真;c. 芯片結(jié)構(gòu)俯
視圖及單個灌流培養(yǎng)單元放大圖
生殖細胞和子宮內(nèi)膜細胞的準備IVF 公鼠的選擇、取精與精子處理 ,具體方法:選擇8 周齡以上、體重大于25 g、雄性特征明顯的公鼠,頸部脫臼致死, 剖開腹部取出附睪及輸精管, 用小鑷子擠壓附睪尾部使精子擠入1 mL 平衡過夜的精子洗液滴中, 去掉附睪組織, 將此液滴置于37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)20 ~25 min, 使精子自由浮動。精子獲能操作參考精子洗液試劑盒說明書進行,具體方法:取10 μL 上述初步孵育、分散較好的活躍精子懸浮液加入到50 μL 平衡過夜的精子洗液滴中, 用血細胞計數(shù)器計算精子濃度并調(diào)整至2*105 ~5 *105個/ mL, 將此精子懸浮液置于37 ℃、5 % CO2 和飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h。具體方法:選擇6 周齡以上、體重大于20 g 的健康母鼠,每只母鼠腹腔注射10 IU PMSG, 間隔48 h 后再注射10 IU HCG, 間隔13 ~17 h 待用。將上述處理的母鼠于注射HCG 后13 ~17 h, 取其輸卵管置于1 mL 卵細胞洗滌液中, 自輸卵管壺腹部取出成熟卵冠丘復(fù)合體(Oocyteμcoronaμcumulus complex, OCCC),用0. 3 % 透明質(zhì)酸酶溶液處理去除卵丘細胞, 再用50 μL 洗滌液沖洗4 次, 得到成熟裸卵。
小鼠子宮內(nèi)膜細胞在培養(yǎng)瓶中進入指數(shù)生長期后收獲并制成密度為2*105 / mL 的細胞懸液備用。
芯片實驗操作
芯片和聚四氟乙烯毛細管在使用之前80 益烘烤1 h,微量注射器在75% 乙醇中浸泡6 h 后用滅菌蒸餾水沖3 次。使用前芯片、毛細管和注射器均置于紫外燈下照射,使用時在超凈工作臺上將芯片與注射器通過毛細管連接。明膠用滅菌雙蒸水配制成0. 5% 的溶液。部分實驗中使用CellTracker Green 標記小鼠子宮內(nèi)膜細胞,以CellTracker Red 標記卵細胞。CellTracker 工作液使用二甲基亞砜新鮮配置。細胞標記步驟如下:淤收集細胞懸液后離心,吸取上清液,加入CellTracker 染液于細胞懸液中至終濃度10 μmol/ L,37益孵育30 min;于將細胞離心,棄上清后加入PBS 緩沖液,37 益孵育10 min;盂再次離心并加入PBS 緩沖液洗滌細胞,目的在于清除未結(jié)合染料。用CellTracker Green 標記細胞在熒光顯微鏡下觀察時用藍光激發(fā)觀察,而CellTracker Red 標記細胞用綠光激發(fā)觀察。
芯片操作步驟如圖2 所示:
(a)芯片通道出入口1, 4 開放,2, 3 關(guān)閉。操作前先用0. 5% 明膠溶液灌注芯片通道2 min。微量注射泵抽取20 mL 子宮內(nèi)膜細胞懸液從芯片進樣通道緩慢注入,該步驟使子宮內(nèi)膜細胞沉積在上層通道的卵細胞捕獲區(qū)。排出剩余細胞懸液后芯片靜置于培養(yǎng)箱中靜置8 h 后,用齊氏實驗室配制的子宮內(nèi)膜培養(yǎng)基以10 μL/ h 流速灌流培養(yǎng);
(b)培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞24 h后,芯片通道出入口1, 2 開放,3, 4 關(guān)閉,以10 μL/ h 流速引入小鼠卵細胞懸液以將卵細胞其捕獲于微網(wǎng)中;
(c)繼而以10 μL/ h 流速向通道引入獲能精子,保留6 h 完成受精;
(d) 芯片通道出入口3, 4開放,1,2 關(guān)閉,以10 μL/ h 速度持續(xù)灌流M16 胚胎培養(yǎng)液。實驗期間每隔24 h 在倒置顯微鏡下觀察芯片中胚胎的發(fā)育情況并拍照記錄。
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芯片上細胞共培養(yǎng)機制的建立
如圖3 所示,在連接芯片出入口的4 路微量注射泵協(xié)同控制下,可以完成一系列細胞操作。首先利用多孔濾膜截留子宮內(nèi)膜細胞,繼而用微篩網(wǎng)捕獲卵細胞。這樣,卵細胞貼附于子宮內(nèi)膜細胞層上,模擬了排卵過程。貼附有子宮內(nèi)膜細胞的濾膜模擬子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu),不僅對卵細胞起到支持、保護和營養(yǎng)作用,還可以通過細胞連接建立細胞之間的通訊。濾膜上的細胞藉由濾孔與底部的灌流培養(yǎng)液進行物質(zhì)交換,模擬了體內(nèi)細胞與毛細血管之間的物質(zhì)交換形式。這種結(jié)合主動灌流與被動擴散的物質(zhì)運輸形式,不僅避免了流體剪切力對于細胞的傷害,而且還可以及時排除代謝產(chǎn)物,消除代謝物蓄積對細胞生長發(fā)育的不利影響。這種包含細胞μ細胞相互作用以及細胞μ外界物質(zhì)交換作用的芯片共培養(yǎng)體系,有效模擬了子宮內(nèi)部的微環(huán)境。
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圖3搖芯片操作步驟示意圖(箭頭表示液流方向)
芯片子宮內(nèi)的受精及著床
卵細胞培養(yǎng)24 ~48 h 后,向芯片引入獲能的小鼠精子模擬受精過程。少量精子接觸卵細胞后與其結(jié)合,約6 h 后完成受精。受精后繼續(xù)灌流培養(yǎng),培養(yǎng)液一方面為受精卵不斷補充新的營養(yǎng)物質(zhì),另一方面可以及時排除代謝廢物。受精后約12 h 后能觀察到小鼠精卵細胞結(jié)合。受精卵經(jīng)過連續(xù)多次分裂之后在4 d 內(nèi)形成桑椹胚(16 細胞),后者在芯片通道內(nèi)繼續(xù)分裂形成囊胚(32 細胞),大約在受精后6 ~8 d 進入子宮內(nèi)膜層完成著床(見圖4)。
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圖4搖連續(xù)觀察芯片上受精卵細胞
實驗比較了芯片子宮與傳統(tǒng)方法獲得的2μ細胞率、4μ細胞率、桑椹胚率和囊胚率,這些指標可以動態(tài)地反映胚胎生成狀況。在離體培養(yǎng)哺乳類動物(包括人)受精卵時發(fā)現(xiàn),在一些化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中受精卵往往不能發(fā)育到囊胚,而是停頓在某個特定的發(fā)育時期,這種現(xiàn)象被稱作“發(fā)育阻斷冶。“發(fā)育阻斷冶發(fā)生的具體機制尚不明了,分析可能是由于體外環(huán)境中存在不利于胚胎生成的因素。為了克服胚胎體外發(fā)育阻斷,實驗在芯片上采用卵細胞與子宮內(nèi)膜細胞灌流共同培養(yǎng)方法,提供高度仿真的微環(huán)境以促進胚胎發(fā)育。
結(jié)果顯示,培養(yǎng)皿組的2-細胞體,4-細胞體,桑椹胚以及囊胚數(shù)目分別為202,149,128 和73,而芯片組的對應(yīng)數(shù)值為206,200,159 和122。芯片組受精卵各時期地發(fā)育情況均優(yōu)于培養(yǎng)皿組(圖5)。雖然兩組的受精情況(2-細胞率)大致相當,但在胚胎逐漸發(fā)育的過程中體現(xiàn)出明顯差異。結(jié)果表明,芯片組桑椹胚率和囊胚率明顯高于培養(yǎng)皿對照組,以囊胚率的提高最為顯著。相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿方法,本研究發(fā)展的芯片子宮方法更有利于提高受精率及囊胚率與單純的卵細胞培養(yǎng)相比,微流控芯片子宮更有利于體外小鼠胚胎發(fā)育。
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分析其原因可能為:
(1)子宮內(nèi)膜上皮細胞模擬體內(nèi)子宮內(nèi)環(huán)境,可分泌一些對早期胚胎發(fā)育有利的物質(zhì);
(2)子宮內(nèi)膜上皮細胞可能通過與胚胎的相互作用促進其發(fā)育;
(3)所采用的灌流培養(yǎng)方法模擬了生理狀態(tài)細胞與外界的物質(zhì)交換形式,不僅為細胞提供充足的養(yǎng)分, 還可以及時清除對于胚胎發(fā)育不利的代謝產(chǎn)物。
綜上所述,研究通過在微流控芯片上細致仿真子宮的結(jié)構(gòu)和功能形成了一個類似于子宮的微環(huán)境。這種芯片子宮有利于卵細胞受精及受精后胚胎的生長發(fā)育,并能得到質(zhì)量較好的胚胎。該技術(shù)除可應(yīng)用于人類生殖醫(yī)學(xué)工程,還可為深入研究胚胎發(fā)育機制及動物胚胎工程提供優(yōu)質(zhì)的胚胎,具有較為廣闊的應(yīng)用前景。
結(jié)論
發(fā)展了一種微流控芯片子宮,通過使用子宮內(nèi)膜細胞-胚胎共培養(yǎng)以及連續(xù)灌流方式細致模擬子宮環(huán)境以促進胚胎生成。利用上述芯片子宮,完成了排卵、受精、著床以及胚胎發(fā)生等一系列實驗過程。芯片子宮不僅操作簡便,還可以獲得較之傳統(tǒng)方法更高的胚胎形成率。我們的后續(xù)實驗會將芯片子宮發(fā)生的囊胚移植到動物子宮,直至發(fā)育成胎兒。
作者：李偉萱 李廣鐵 嚴偉 張瓊 王維 周小棉 劉大漁