我國是肺癌高發(fā)國家,近十年肺癌的發(fā)病率分別占男性和女性惡性腫瘤的第一和第二位,并且發(fā)病年齡有下降的趨勢。肺癌的死亡率在惡性腫瘤中始終居于首位，根本原因是肺癌的高轉(zhuǎn)移能力。因?yàn)榉伟┚哂袠O強(qiáng)的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期（III期、IV期），失去最佳的治療機(jī)會(huì)。因此，提高肺癌檢出率、控制轉(zhuǎn)移是臨床亟待解決的難題。

    現(xiàn)有的肺癌診斷手段主要包括影像學(xué)、血清腫瘤標(biāo)志物、組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查。影像學(xué)檢查能夠直觀地評(píng)價(jià)肺癌的大小和進(jìn)展情況，但靈敏度有限，很難檢測到微小病灶。血清腫瘤標(biāo)志物檢測可用于輔助診斷、監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)，但是目前尚缺少特異的肺癌血清腫瘤標(biāo)志物，易出現(xiàn)假陽性和假陰性。病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)診斷是肺癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是要通過手術(shù)或者穿刺的方法獲得活檢樣本，對患者創(chuàng)傷較大，而且取材受限，不能實(shí)時(shí)監(jiān)測肺癌的動(dòng)態(tài)發(fā)展。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell, CTC）檢測作為一種液體活檢技術(shù)，試圖克服現(xiàn)有肺癌診斷手段的不足，提高肺癌檢出率。研究表明CTC檢測有助于預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移、評(píng)估預(yù)后，而且可以反映腫瘤特征，作為靶向治療的靶標(biāo)指導(dǎo)治療。同時(shí)，外周血CTC檢測具有創(chuàng)傷小、順應(yīng)性好、操作方便及可重復(fù)操作等優(yōu)勢。因此，作為一種“液體活檢”技術(shù)，CTC檢測有助于提高肺瘤的檢出率，為患者爭取最佳治療時(shí)間，制定最適的治療方案，從而改善患者預(yù)后。然而，由于CTC數(shù)量微少，平均109個(gè)血細(xì)胞中約有1-100個(gè)CTC。因此，構(gòu)建高效、高特異性的檢測方法對CTC的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

現(xiàn)有的CTC檢測和富集分選技術(shù)依據(jù)分離原理的不同，主要分為兩大類，一類是基于物理學(xué)特性的分選，另一類是基于生物學(xué)特性。前者主要是依據(jù)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞的尺寸不同、密度不同、所帶電荷不同等方法將CTC從外周血中分選。優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、快捷、高通量且成本相對較低等，但缺點(diǎn)是分選效率不高、純度較差。后者主要是依據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)，根據(jù)CTC表面所表達(dá)的特異性蛋白，通過免疫親和反應(yīng)將其分離，其中最常見的特異性蛋白是上皮粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）及細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin, CK）。其中，被FDA認(rèn)證的Cellsearch System就是根據(jù)正分選原理，通過納米磁顆粒富集上皮來源的CTC，推薦應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌的CTC檢測。但是，由于CTC具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，使該方法在一些患者中的CTC檢測效果并不理想 。因此，如何克服CTC檢測手段的局限性，構(gòu)建高效的CTC檢測技術(shù)倍受關(guān)注。

    隨著微流控技術(shù)對細(xì)胞生物學(xué)影響的不斷加深,以及其在集成樣品預(yù)處理和血液成分分析中的優(yōu)勢，使其可以更溫和、快速、一致地操控和分選活細(xì)胞，有利于更準(zhǔn)確高效地提取血液等體液樣品中的信息，非常適用于血細(xì)胞、癌細(xì)胞等體細(xì)胞的檢測。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在腫瘤細(xì)胞的微流控分選領(lǐng)域中取得了一系列的成就，微流控芯片技術(shù)正逐步成為細(xì)胞分選的主要工具，應(yīng)用微流控芯片技術(shù)可精確操控樣品中的細(xì)胞，有望實(shí)現(xiàn)高效率、高純度的CTC檢測。同時(shí)，微流控芯片的制作成本較低、體積較小，易于制備便攜式儀器，更易臨床普及應(yīng)用。基于微流控芯片的CTC檢測方法主要分為兩類，一類是基于物理學(xué)特性的檢測，另一類是基于生物學(xué)特性。前者最常見的是應(yīng)用過濾芯片或確定性側(cè)向位移（deterministic lateral displacement, DLD）芯片，根據(jù)細(xì)胞尺寸大小的不同，將CTC與血細(xì)胞分離。Zheng等設(shè)計(jì)的濾過膜芯片在0.1-0.2mL/min的通量下可實(shí)現(xiàn)80%的腫瘤細(xì)胞株捕獲率，Chen等設(shè)計(jì)的DLD芯片在1mL/min的通量下可實(shí)現(xiàn)95%的腫瘤細(xì)胞株捕獲率。生物學(xué)特性的分選主要是根據(jù)免疫親和反應(yīng)將CTC捕獲，其中最常見的是“人字”芯片或“HB芯片”，HB芯片是在普通芯片的基礎(chǔ)上通過人字形微柱的設(shè)計(jì)，使血樣流經(jīng)芯片時(shí)產(chǎn)生微量渦流來實(shí)現(xiàn)血液細(xì)胞的被動(dòng)混合，以顯著增加目標(biāo)CTC和抗體包被芯片表面之間的相互作用次數(shù)，顯著提高CTC的分離效率。Shannon等設(shè)計(jì)了人字形魚骨芯片，在流速(0.12 mL／h)下可實(shí)現(xiàn)79%±4.5%腫瘤細(xì)胞捕獲效率及50%左右捕獲純度。Nagrath等將anti-EpCAM抗體包被在芯片微柱上，通過腫瘤標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株檢測，實(shí)現(xiàn)99%的高捕獲效率及47%的捕獲純度。以上研究提示，應(yīng)用微流控芯片技術(shù)有望克服CTC檢測技術(shù)的不足，實(shí)現(xiàn)高效、高特異性的CTC檢測，但是目前大多研究是在細(xì)胞株水平進(jìn)行的，對患者外周血CTC檢測的研究尚不足。

因此，應(yīng)用微流控芯片技術(shù)，國內(nèi)某研究小組構(gòu)建了適于肺癌CTC檢測的裝置，并將該裝置用于患者外周血CTC檢測。該裝置聯(lián)合了DLD分選平臺(tái)、磁場負(fù)性分離純化平臺(tái)及免疫親和捕獲平臺(tái)，以實(shí)現(xiàn)高效的、高特異性的CTC檢測。應(yīng)用該裝置，國內(nèi)某研究小組分別對標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株、肺癌患者CTC進(jìn)行檢測，并與CTC檢測金標(biāo)準(zhǔn)CellSearch System的檢測結(jié)果進(jìn)行了對比。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株的檢測結(jié)果提示該裝置可實(shí)現(xiàn)90%以上的檢測效率及50%的檢測純度，且該裝置對細(xì)胞的活性無明顯影響，可用于下一步的相關(guān)分析。肺癌患者外周血CTC的檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了裝置具有良好的檢測效能。芯片裝置與CTC檢測金標(biāo)準(zhǔn)CellSearch System對30例腫瘤患者外周血CTC檢測結(jié)果提示二者在檢測效能上無明顯差異，但是在檢測所需標(biāo)本量、檢測時(shí)間、檢測成本、臨床普及性等方面，芯片裝置具備明顯的優(yōu)勢。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了芯片裝置具備良好的CTC檢測效能，可用于臨床CTC檢測。因此，國內(nèi)某研究小組應(yīng)用該裝置對55例腫瘤患者外周血CTC進(jìn)行檢測，分析了CTC數(shù)目與腫瘤分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及患者病情的關(guān)系，檢測結(jié)果提示CTC數(shù)目與腫瘤分期相關(guān)，早期（I、II）患者，檢測結(jié)果為陰性，晚期患者（III、IV），檢測結(jié)果通常為陽性，且隨著分期的增高，檢出陽性率逐漸升高。而且檢測結(jié)果與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，檢測結(jié)果為陽性的患者通常已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，而未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者，檢測結(jié)果為陰性。另外，檢測結(jié)果與患者病情相關(guān)，對于病情復(fù)發(fā)或進(jìn)展的患者，檢測結(jié)果通常為陽性，對于病情緩解或穩(wěn)定的患者，檢測結(jié)果為陰性。綜上所述，應(yīng)用微流控芯片技術(shù)，我們課題組成功構(gòu)建了CTC檢測裝置，可用于肺癌患者的CTC檢測，且檢測結(jié)果有助于臨床肺癌分期、轉(zhuǎn)移狀態(tài)評(píng)估、患者病情分析及治療方案的選擇。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來，肺癌的診治正在一步步向精準(zhǔn)化、個(gè)體化、綜合化的治療方向發(fā)展。而這種發(fā)展方向是有原因的，首先，肺癌是一種基因疾病，多樣且復(fù)雜，即使在顯微鏡下形態(tài)一致的腫瘤，在臨床上卻可能有著截然不同的療效以及預(yù)后；其次，肺癌本身在分子遺傳學(xué)上具有異質(zhì)性，并且隨著疾病的進(jìn)展處于不斷演化的狀態(tài)；最后，因?yàn)榉伟┲委熕幬飪r(jià)格高昂，不恰當(dāng)?shù)闹委煂?huì)給病人甚至是整個(gè)社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)和資源浪費(fèi)。由此肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療應(yīng)運(yùn)而生，CTC檢測這一液體活檢技術(shù)的到來，為肺癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的實(shí)現(xiàn)帶來了新的希望。最近，已經(jīng)有大量針對CTC的分子研究，從富集的CTC群體中提取細(xì)胞DNA和RNA進(jìn)行深入的基因組學(xué)分析，但由于CTC的富集過程存在白細(xì)胞的污染，所以分析結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性。例如，Punnoose等人分析了CellSearch?在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中富集的CTC中的EGFR突變狀態(tài)，在腫瘤活檢確認(rèn)攜帶EGFR突變的8例患者中只有一例可檢測到基因突變。隨著研究的進(jìn)展，單個(gè)CTC的基因組分析克服了白細(xì)胞污染所造成的限制，能夠評(píng)估單個(gè)CTC之間的異質(zhì)性并有助于鑒定細(xì)胞內(nèi)共存的突變。而且CTC單細(xì)胞基因組測序分析可從分子水平明確腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥的機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。單細(xì)胞的分選方法主要包括顯微鏡下手動(dòng)毛細(xì)胞吸取法、阻抗脈沖信號(hào)芯片捕獲法、陣列芯片分選法等。目前，我們課題組正致力于肺癌CTC單細(xì)胞的相關(guān)研究，通過基因組測序技術(shù)，分析肺癌CTC異質(zhì)性，深入探究肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥的機(jī)制，為肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療提供新的思路。

綜上所述，CTC檢測作為一種液態(tài)活檢技術(shù)有望克服臨床肺癌診斷低的難題，CTC檢測有助于肺癌分期、轉(zhuǎn)移預(yù)測、治療方案選擇及預(yù)后評(píng)估。應(yīng)用微流控芯片技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高效的、高特異性的CTC檢測。CTC捕獲后的單細(xì)胞測序分析可從分子水平揭示肺癌的本質(zhì)，深入探討肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥的機(jī)制，從而制定個(gè)體化治療方案，實(shí)現(xiàn)肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療。